Главная


Адаптация сайта для Гугла и Яндекса

Конъюгаты ДНФ-белок

Материалы и оборудование. Для работы необходимы бычий γ-глобулин, динитробензол-сульфонат натрия, К2СО3, сефадекс G-25, хроматографические колонки.

Методика

В 50 мл воды растворяют 1,0 г бычьего γ-глобулина и 1,0 г К2СО3, затем добавляют 1,0 г 2,4-динитробензолсульфоната натрия или калия (в 10-кратном молярном избытке по отношению к содержанию лизина в белке). Инкубацию проводят при 37 °С при постоянном перемешивании. За 24 ч инкубации при 25 °С происходит замещение 50—60 групп на одну молекулу γ-глобулина (максимальное замещение 70 групп). Реакцию проводят в темноте, поскольку ДНФ-группы светочувствительны. По окончании реакции ДНФ-белок очищают гель-фильтрацией на сефадексе G-25.

Дополнительные замечания

Определение ДНФ-групп в белке проводят спектрофотометрически на волне 360 нм. В качестве коэффициента экстинкции используют молярный коэффициент экстинкции ε-ДНФ-лизина, который при рН 7,4 составляет 17 530. Число ДНФ-групп соотносят со средней относительной молекулярной массой белка. Количество белка определяют микромодификацией метода Кьельдаля или по сухому весу. Для определения сухого веса препарат диализуют против дистиллированной воды или раствора ацетата аммония. Препарат высушивают в вакууме при 105 °С, в этих условиях ацетат аммония улетучивается за 1— 3 дня. Например, при содержании белка 16,8 мг/мл и экстинкции 87,5 при 360 нм на молекулу бычьего γ-глобулина (отн. мол. масса 160 000) приходится в среднем 50 ДНФ-групп. Динитробензолсульфонат натрия очищают путем перекристаллизации из спиртового раствора и адсорбции активированным углем. Его точка плавления превышает 3.00 °С.

Молярный коэффициент экстинкции при 360 нм составляет 280, после нагревания в 0,02 М NaOH при 90 °С в течение 1 ч коэффициент экстинкции увеличивается до 14 000 (превращение в динитрофенол). ДНФ-белки хранят в водном растворе при —20°С или 4°С. Белки стабильны, но их следует сохранять в темноте. Белки с высокой степенью замещения выпадают в осадок в 0,15 М NaCl. В концентрациях ниже 1 мг/мл препараты замещенных белков растворимы в 0,1 М трис с 0,1 М NaCl (рН 7,6) или в ФСН (рН 7,6).

Очистку ДНФ-белков после реакции с динитробензолсульфонатом от непрореагировавших ароматических динитросоединений проводят не только путем гель-фильтрации на сефадексе G-25, но также диализом против воды при рН 7,8 и выше, при помощи ионообменников или осаждением при рН ниже 4. Если замещены все NH2-rpynnbi, ДНФ-белок нерастворим в среде с рН ниже 4. Если степень замещения невелика, то растворимость белка может быть при рН 1—2 даже большей, чем при рН 3—4. ДНФ-производные белков предпочтительнее получать с использованием динитробензолсульфоновой кислоты, хотя, например, динитрофторбензол. реагирует энергичнее.

В реакцию с динитробензолсульфонатом вступают почти исключительно ε-аминогруппы лизина. N-концевыми аминогруппами на практике можно пренебречь. Фенольные ОН-группы тирозина в вышеописанных условиях не вступают в реакции, сульфгидрильные группы также не оказывают влияния на степень замещения. К числу преимуществ данного метода относится то, что динитробензолсульфонат, в противоположность динитрофторбензолу, хорошо растворим в воде и для его удаления по окончании реакции не требуются органические растворители. Аналогично ДНФ-белкам могут быть получены ТНФ-производные путем взаимодействия тринитробензолсульфоновой кислоты и белка в 0,2 М боратном буфере с рН 9,2. Эффективность замещения ТНФ-группами определяется по измерению оптической плотности при 348 нм; молярный коэффициент экстинкции ε-ТЕФ-лизина равен 15 400.